自年初以来，冠状病毒疾病（COVID-19）大流行对公共卫生安全构成了巨大挑战。COV的主要蛋白酶（Mpro，3CLpro）在病毒复制中起着重要作用，这使其成为抗病毒药物开发的诱人靶点。如今有数十种SARS-CoV-2Mpro抑制剂被报道，其中一些已进入临床试验，但到目前为止，没有一种被批准用于COVID-19治疗。在这项研究中，作者发现蛋白酶体抑制剂MG和半胱天冬酶抑制剂如Z-VAD（OMe）-FMK是有效的SARS-CoV-2抑制剂。
SARS-CoV-2Mpro热稳定化合物
上海交通大学医学院研究团队使用蛋白质热稳定性作为读数，从包含美国食品和药物管理局（FDA）批准的药物和临床阶段或已知目标化合物的4,个化学实体库中筛选出SARS-CoV-2Mpro热稳定化合物。通过使用差示扫描荧光法（DSF）把Z-VAD（OMe）-FMK、MG、boceprevir、thermopsine和黄芩素列为前五的SARS-CoV-2Mpro热稳定化合物，这五个化合物可使Mpro的熔化温度至少提高2℃。
Fig1.在试点DSF筛选中与4,种化合物孵育后SARS-CoV-2的（ΔTm）
在浓度滴定中验证了前五名Mpro热稳定化合物，其中Z-VAD（OMe）FMK始终是最有效的Mpro稳定化合物。接下来，作者预测了这5个靶点的Mpro结合模式，并进行了结构-活性关系（SAR）分析。Mpro的底物结合囊含有四个子站点（S1′、S1、S2和S4），在所有CoVMpro同源物中高度保守。
Fig2.MG在SARS-CoV-2Mpro活性位点的结合方式
作者之前设计了一系列具有经典核心结构的Mpro抑制剂，其中四个子组（弹头、R1、R2和R3）分别占据Mpro的四个子站点，由N31、11a2、GC、ndmI-确定。
Fig3.MG与11a（PDBcode:6LZE）、11b（PDBcode:6M0K）、GC（PDBcode:6WTT）、N3（PDBcode:6LU7）活性位点的结合方式比较
在前五名中，黄芩素和黄华碱是低分子量的天然产物，因此它们不太可能占据所有四个子站点。
Mpro位点结合
据报道，Boceprevir的功能基于经典的核心结构，并阐明了Mpro的结合机制。剩余的两个片段，MG和Z-VAD（OMe）FMK，在结构上具有经典的核心结构，因此计划以常规结合模式结合到Mpro的活性位点。需要注意的是，Z-VAD（OMe）FMK在计划的结合模式中缺少R2子组。
Fig4.Z-VAD(OMe)FMK在SARS-CoV-2Mpro活性位点的结合方式
作者收集了34种与MG和Z-VAD（OMe）-FMK具有高度结构相似性的市售化合物。其中，三种半胱天冬酶抑制剂和三种蛋白酶体抑制剂可检测到稳定Mpro。缺少半胱氨酸结合弹头的17种化合物未能稳定Mpro。
后续收集了25种市售半胱天冬酶和蛋白酶体抑制剂。
DSF结果表明：
（1）拥有核心结构是成为合格的Mpro热稳定剂的先决条件；
（2）排名前5位的强效化合物都含有氟甲基酮（FMK）弹头；
（3）小尺寸R2与高效能有关。
总之，三种最有效的Z-VAD（OMe）-FMK、Z-DEVD-FMK和Z-IETD-FMK包含一个FMK弹头和小型R2的核心结构。为了验证Mpro是MG在原子水平上的直接靶点，作者求解了Mpro-MG的高分辨率晶体结构。两个Mpro分子形成对称的同型二聚体，MG基于经典核心结构结合到活性位点，其中醛、Leu侧链、Leu第二侧链和苄氧羰基（Cbz）分别作为弹头R1、R2和R3。质谱（MS）未发现MG与Mpro孵育后的分子量有明显增加，这可能是由于MG醛和目标半胱氨酸之间的高度动态和可逆键的影响。
MG和SARS-CoV-2Mpro结合的方式与蛋白酶体20S亚单位结合的方式明显不一样是因为结合囊的形状不同。但是，它类似于所报道的基于经典核心结构的Mpro抑制剂。值得注意的是，MG亚单位的R1、R2和R3均来源于疏水性Leu和Cbz，它们与Mpro发生广泛的疏水相互作用。MG的核心结构与Mpro形成四个氢键（与报道的抑制剂相当），其中R1、R2和R3亚单位与Mpro仅形成一个氢键。
Fig5.MG在SARS-CoV-2Mpro活性位点的结合方式。粉色区域代表mprosubsite与MG之间的疏水相互作用网络
接下来又求解了Mpro-ZVAD（OMe）-FMK复合物的高分辨率晶体结构，其中不对称单元包含一个分子。然而，Z-VAD（OMe）-FMK意外结合到Mpro的活性位点。
Fig6.Z-VAD(OMe)-FMK在SARS-CoV-2Mpro活性位点与11a(PDBcode:6LZE)、11b(PDBcode:6M0K)、GC(PDBcode:6WTT)、N3(PDBcode:6LU7)的结合方式比较
FMK经常被用作连接半胱天冬酶半胱氨酸的弹头。据我们所知，还没有报告将其用于SARSCoV-2Mpro抑制剂，Mpro-Z-VAD（OMe）-FMK的结合模式与caspase-1Z-VAD-FMK的结合模式差异明显，Z-VAD（OMe）-FMK分子线性占据caspase-1的狭长口袋。由于R3重新定向，Z-VAD（OMe）-FMK与Mpro的结合模式与先前报道的Mpro抑制剂完全不同。
Fig7.总结了Mpro-Z-VAD(OMe)-FMK的结合方式
R2的缺失、柔性疏水R3的重新定向以及S2-S4接合部位的紧密占据可能有助于Z-VAD（OMe）-FMK稳定SARS-CoV2Mpro。在本次研究准备过程中，一个独立小组在PDB数据库中发布了Mpro-Z-VAD（OMe）-FMK（PDBID:7C8B）的晶体结构，证实了所观察到的非常规结合模式。
抗病毒活性测定
采用荧光共振能量转移法（FRET）体外测定了三种caspase抑制剂和MG对SARS-CoV-2Mpro的抑制活性。三种caspase抑制剂均表现出较强的Mpro抑制作用，其半数抑制浓度（IC50）均在纳米摩尔和低微摩尔范围内，而MG的IC50则更高（3.91μM）。总体而言，三种caspase抑制剂的ic50值与合理设计的Mpro抑制剂具有可比性。
Fig8.36种化合物(Mpro:化合物的摩尔比为1:10)诱导的ΔTm
接下来在Vero细胞中测定了这四种化合物对SARS-CoV-2的抗病毒活性。在SARS-CoV-2感染后24小时，三种半胱天冬酶抑制剂在Vero细胞的纳摩尔和低微摩尔范围内显示出有效的半最大有效浓度（EC50）（0.64–1.88μM）。与其他两种半胱天冬酶抑制剂相比，Z-VAD（OMe）-FMK在酶活性测定中表现出更高的效能，而在抗病毒活性测定中表现出较低的效能。它可能与Z-VAD（OMe）-FMK在基于细胞的抗病毒试验中抑制Mpro时的潜在“脱靶”效应有关。
Fig9.在指示化合物浓度增加的情况下，测定了SARS-CoV-2Mpro的水解活性
在Vero细胞中，没有一种受试的半胱天冬酶抑制剂引起细胞毒性。MG对该细胞系具有细胞毒性，其EC50无法可靠测定。扩展的细胞毒性研究一致表明，这三种半胱天冬酶抑制剂对细胞相对无毒。
Fig10.化合物对SARS-CoV-2的抗病毒活性及在Vero细胞中的细胞毒性
与在同一Vero细胞中测定的已报道的Mproinhibitors的抗SARS-CoV-2活性相比，无毒的caspase抑制剂优于N31、Boceprevir3和GC-，与报导的六种最有效的Mpro抑制剂（MI-09/12/14/28/30/31）相当，但比之前优化的11a/b更有效。
总结
作者鉴定出MG、Z-VAD（OMe）-FMK及其结构类似物为直接结合Mpro的小分子，具有抗SARS-CoV-2抗病毒活性。MG被广泛认为是一种CoV抑制剂，有多个报道和建议的靶点。此研究提供了单原子分辨率的证据证明Mpro是MG的直接靶标。
与报道设计的Mpro抑制剂相比，Z-VAD（OMe）-FMK以非传统的结合方式与Mpro活性位点结合，这可能有助于观察到Z-VAD（OMe）-FMK在抑制SARS-CoV-2方面的高效力。此次研究提供了明确的结构证据，以支持设计一种有效的SARS-CoV2Mpro抑制剂的替代策略。
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参考资料
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